El 25 de febrero de 1570, Pío V publica la bula Regnans in Excelsis, declarando a Isabel usurpadora, hereje, liberando a sus súbditos de todo juramento de obediencia hacia ella y excomulgando a todo aquel que contradiga esta orden. La respuesta católica tardó 11 años en llegar y fue emitida en apoyo de la fallida rebelión del norte, una revuelta propiciada por Tomás Howard, cuarto duque de Norfolk, el terrateniente más rico del país. Tras el fracaso de la rebelión, sus líderes fueron ejecutados y se llevó a cabo una purga de simpatizantes católicos. Norfolk fue encerrado en la Torre durante 9 meses y solo fue liberado bajo arresto domiciliario cuando confesó todo y rogó clemencia.

Uno de los implicados en la rebelión fue Roberto di Ridolfi, un banquero florentino y conspirador católico. El fracaso de la rebelión y la publicación de la bula, que literalmente autorizaba matar a Isabel, le hizo comprender que solo la intervención extranjera podía restaurar el Catolicismo y poner a María Estuardo en el trono, por lo que empezó a contactar a potenciales adeptos. John Lesley, obispo de Ross, accedió al complot como la única forma de liberar a María, quien había llegado a Inglaterra tras ser destronada en Escocia y actualmente estaba recluida pues, siendo prima de Isabel, católica y potencial reclamante, representaba un peligro para su gobierno.

El plan consistía en dejar que el Duque de Alba invadiera Inglaterra desde los Países Bajos con un ejército de 10.000 hombres, fomentar una rebelión de la nobleza norteña, asesinar a Isabel y casar a María con Tomás Howard. Ridolfi consideró de manera optimista que la mitad de la población inglesa era católica y que podía reunir sobradamente 39.000 hombres. Norfolk ofreció garantías verbales de que era católico y, con su venia, Ridolfi partió al continente para ganar apoyo del Duque de Alba, Pío V y el rey Felipe II. Sin embargo Alba no los apoyó porque temía que, si María gobernaba, Inglaterra y Francia se unirían contra España.

En tanto, la red de inteligencia de Isabel no paraba de trabajar. Al ganarse la confianza del embajador español, John Hawkins se enteró de todo y notificó al gobierno para que arrestara a los conspiradores. Charles Baillie, mensajero de Ridolfi, fue detenido en Dover con cartas comprometedoras y reveló la existencia del complot bajo tortura. Norfolk fue arrestado y enviado a la Torre, siendo ejecutado por traición el 2 de junio de 1572. Ridolfi estaba todavía fuera del país cuando la conspiración fue descubierta y nunca regresó a Inglaterra, convirtiéndose en senador florentino en 1600.

Al ser interrogada, María admitió haber tratado con Ridolfi pero negó cualquier participación en la conspiración, pese a que la evidencia la delataba. Siendo una reina coronada y ungida, Isabel se negó a ejecutarla y vetó una ley del Parlamento que la sacaba de la sucesión. ​ No obstante, María pasó de ser una invitada bienvenida a una traidora y fue universalmente repudiada por la clase gobernante