Entre 1583 y 1586, Isabel I fue blanco de dos intentos de asesinato a manos de los católicos europeos, quienes la consideraban ilegítima por ser hija de Ana Bolena y encima protestante, por lo que estaban dispuestos a ignorar el quinto mandamiento, obedecer al papa Gregorio XIII (quien dijo que matar a Isabel no sería un pecado) y reemplazarla por su prima, María Estuardo, destronada reina de Escocia que se encontraba cautiva en Inglaterra. En un país mayormente protestante, el catolicismo constituía la expresión religiosa de una política cruel y traidora, además de reflejar la dominación europea por parte de España. Francis Walsingham, astutamente, construyó una red de espías e infiltrados en distintas embajadas para detectar complots, la cual probó ser útil cuando sus agentes frustraron la conjura de Throckmorton, un intento perpetrado por el hermano de una de las damas de la reina. Throckmorton fue ejecutado en 1584 y Bernardino de Mendoza, embajador español cómplice de la conjura, fue expulsado del país.

En 1580, el noble Antony Babington conoció a John Ballard, quien le habló de una conjura para matar a Isabel y reemplazarla por María Estuardo, que se encontraba bajo arresto domiciliario. El acto sería llevado a cabo por otro exiliado inglés, John Savage. Lo que no sabían era que uno de ellos, Gilbert Gifford, era en realidad un agente doble al servicio de Walshingham. Gifford inventó un método secreto para descifrar y codificar las cartas para comunicarse con María, que debía aprobar el plan. Si ella accedía, la operación se pondría en marcha. La reina escocesa dudó, pero finalmente aceptó por escrito en julio de 1586. Fue entonces cuando Walshingham, que había interceptado y leído todas sus cartas, resolvió que había llegado el momento de actuar.

El 4 de agosto, sus agentes detuvieron a John Ballard. Desesperado, Babington trató de persuadir al exsoldado Savage para que asesinara a Isabel lo antes posible, pero cundió el pánico en el grupo conspirador. Poco después fueron a por Babington quien huyó durante diez días, pero finalmente fue detenido. Los otros conspiradores cayeron uno a uno, siendo interrogados, juzgados, declarados culpables y ejecutados en septiembre.

Aparte de proteger a la reina, el interés de Walsingham era convencer a Isabel de que había que ajusticiar a María Estuardo, porque viva sería siempre un imán de conspiradores católicos. Entre el 15 y 16 de octubre se juzgó a la reina de los escoceses, quien fue condenada a muerte por traición. Isabel tardó en aprobar la ejecución de su prima, en parte porque no quería matar a una reina ungida y porque temía las represalias de Felipe II, rey de España. Finalmente, el 8 de febrero de 1587, María Estuardo fue decapitada. Así, la Reina Virgen sobrevivió a ambas conjuras, mientras el catolicismo inglés acabó desapareciendo, acelerando la fusión entre la identidad nacional y el protestantismo. Tan solo la tolerancia de siglos posteriores marcaría el comienzo de una nueva actitud