Sam et Dean sillonnent les États-Unis à bord d'une Chevrolet Impala noire de 1967 et enquêtent sur des phénomènes paranormaux (souvent issus du folklore, des superstitions, mythes et autres légendes urbaines américaines mais aussi des monstres surnaturels tels que les fantômes, loup garous, démons, vampires...). De manière générale, chaque épisode se déroule dans un lieu différent du pays et correspond à une enquête sur un phénomène paranormal. L'intrigue de la série a évolué au cours des différentes saisons.